Régulation de la croissance des cellules de Schwann in vitro à l’aide de la technique du champ électrique pulsé nanoseconde

Résumé

Source : Han, J., et.al. Régulation de la croissance des cellules de Schwann par champ électrique pulsé nanoseconde pour la régénération des nerfs périphériques in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Cette vidéo démontre l’application de la technique du champ électrique pulsé nanoseconde (nsPEF) pour moduler la croissance des cellules de Schwann (SC). Les impulsions électriques rapides induisent des nanopores transitoires dans les membranes SC, facilitant l’afflux de calcium qui active les voies de signalisation à l’origine de la prolifération, de la dédifférenciation et de la sécrétion de facteurs neurotrophiques SC. Ces réponses cellulaires améliorent le soutien axonal, la survie neuronale et la myélinisation potentielle, mettant en évidence le nsPEF comme un outil prometteur pour la réparation nerveuse.

Protocole

1. Décongélation des cellules RSC96 cryoconservées

1. Décongelez le flacon cryogénique contenant 1 mL de suspension cellulaire en le secouant rapidement dans un bain-marie à 37 °C, puis ajoutez-le dans un tube à centrifuger contenant 4 à 6 mL de milieu de culture complet et mélangez bien.
2. Centrifuger à 1000 x g pendant 3 à 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de culture complet.
3. Ajouter la suspension cellulaire dans un flacon de culture (ou une boîte) contenant de 6 à 8 mL de milieu de culture complet et incuber à 37 °C pendant la nuit.
4. Le lendemain, observez la croissance et la densité des cellules au microscope.

2. Passage cellulaire :

REMARQUE : Si la densité cellulaire atteint 80 % -90 %, il est prêt pour le passage.

1. Jetez le milieu de culture et rincez les cellules 1 à 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans ions calcium et magnésium.
2. Ajouter 0,25 % (p/v) de trypsine-0,53 mM d’EDTA dans le ballon de culture (1 à 2 ml pour un ballon T25, 2 à 3 ml pour un ballon T75) et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 minutes.
3. Observez le détachement cellulaire au microscope. Si la plupart des cellules deviennent rondes et se détachent, remettez rapidement le ballon dans la zone de travail, tapotez doucement le ballon et ajoutez 3 à 4 ml de milieu de culture contenant 10 % de FBS pour arrêter la digestion.
4. Mélangez le contenu, aspirez la solution et centrifugez à 1000 x g pendant 5 min. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension en ajoutant 1 à 2 ml de milieu de culture frais et en pipetant doucement.
5. Transférez la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T25 dans un rapport de 1:2 et ajoutez 7 ml de milieu de culture.

3. Fonctionnement de l’appareil nsPEF

1. Remettre en suspension les cellules RSC96 dans 1 mL de milieu de culture DMEM et les transférer dans des boîtes colorimétriques avec des électrodes des deux côtés.
2. Allumez l’interrupteur d’alimentation.
3. Ajustez les paramètres en tournant le bouton de l’instrument pour modifier l’intensité du champ électrique. Les intensités définies dans cette étude sont de 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm et 40 kV/cm.
4. Faites pivoter soigneusement les électrodes jusqu’à ce que des étincelles apparaissent, ce qui permet aux cellules de recevoir 5 impulsions de nsPEF selon les intensités de champ prédéfinies avant de séparer immédiatement les deux électrodes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alimentation haute tension pour nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Cellules Schwann	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Câble spécial pour nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217